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酵母单杂交(Y1H)
酵母单杂交系统(Yeastone-hybrid,Y1H)是解析细胞内DNA-蛋白质相互作用的经典分子生物学工具。其核心原理基于真核生物转录激活子的结构特征,这类转录激活子通常包含独立发挥功能的DNA结合结构域(DNA Bind-ing Domain,BD)和转录激活结构域(Transcription Activation Domain,AD)。 构建酵母单杂交体系时,将含有特定顺式作用元件的“诱饵”DNA序列整合进酵母基因组,使其与报告基因相连。同时,将潜在结合的转录因子(“猎物")和转录激活结构域AD构建成融合表达载体,导入酵母细胞。若转录因子能特异性结合“诱饵”DNA,AD会招募转录复合物,启动报告基因表达。通过检测报告基因的表达水平,即可判断转录因子与DNA是否存在相互作用。
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双荧光素酶报告实验(Dual-LUC)
双荧光素酶报告实验(Dual-luciferase reporter assay,DLR)是一种在生物学研究中广泛应用的技术,主要用于解析基因表达调控机制,可定量评估转录因子与靶基因启动子的相互作用及启动子活性。该实验通常使用萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)和海肾荧光素酶(Renilla Luciferase)双报告系统: 萤火虫荧光素酶基因常作为报告基因,与目标基因的启动子序列构建在同一载体上,其表达直接受目标启动子调控。 海肾荧光素酶基因作为内参基因,由组成型启动子驱动,在细胞内稳定表达。 当细胞同时转染含有这两种基因的载体后,加入相应的荧光素底物,两种荧光素酶会催化底物发光。通过检测两种荧光信号的强度比值(Luc/Ren),可归一化处理实验数据,消除细胞转染效率、细胞活性等因素对实验结果的影响,从而准确反映目标启动子的活性。
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染色质可及性测序(ATAC-seq)
ATAC-seq(Assay for Transposase Accessible Chro-matin with high-throughput sequencing)是一种在全基因组范围内检测染色质的开放程度的组学技术,可以得到全基因组范围内的蛋白质可能结合的位点信息。 其原理是利用转座酶Tn5容易结合在开放染色质的特性,对Tn5酶捕获到的DNA序列进行测序。该技术可用于分析开放的染色质区域上可能结合的潜在调控蛋白(如:转录因子和辅因子),用此方法与其他方法结合筛查感兴趣的特定调控因子。
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DNA Pull Down
DNA Pull Down是一种新颖的DNA-蛋白互作技术,能够鉴定与特定DNA序列结合的蛋白(转录因子或者DNA结合蛋白)。DNA Pull Down使用生物素标记的DNA探针作为诱饵,与提取的内源细胞核蛋白进行孵育,捕获与DNA探针特异性结合的蛋白(比如转录因子),最终使用蛋白质谱的方法,鉴定出特异性结合的蛋白。
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凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)
凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术。 基于生物素标记探针与对应的DNA结合蛋白的特异性结合原理,通过设计合理、科学的实验方案,蓝景科信为您提供验证性EMSA,竞争性EMSA以及超迁移EMSA(Super-shift EMSA)实验服务。
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