发布日期：2025-09-05浏览次数：32来源：蓝景科信
2025年8月，北京林业大学林木花卉遗传育种教育部重点实验室的研究团队在《Environmental and Experimental Botany》发表一篇题为“PeCPK21 interacts with HMAPs to tolerate elevated cadmium stress in Populus × canescens”的研究论文。该研究借助HaloTag pull-down和质谱分析，揭示了PeCPK21作为Cd²⁺信号传感器，通过与HMAPs互作从多维度增强杨树耐镉性的分子机制，为林木耐镉基因工程提供了重要靶点。
研究背景
镉（Cd²⁺）作为一种高毒性重金属污染物，可通过土壤-植物系统进入食物链，对生态系统稳定性和人类健康构成严重威胁。植物修复技术因成本低、环境友好等特点，成为治理镉污染土壤的重要手段。杨树作为速生树种，具有生物量大、根系与地上部分镉吸收能力强等优势，在镉污染土壤修复中展现出巨大潜力。然而，高浓度镉胁迫会对杨树造成显著毒性，导致叶绿体和线粒体结构畸形，抑制生长与光合作用，限制其修复效率。因此，通过基因工程手段提高杨树的镉耐受性成为当前研究热点。钙依赖蛋白激酶（CPKs）作为钙信号传感器，在植物应对镉胁迫中发挥关键作用。拟南芥中，AtCPK21和AtCPK23通过磷酸化转运蛋白NRAMP6限制镉积累。前期研究发现，胡杨PeCPK21在拟南芥中可与重金属转运相关蛋白及转录因子AtNFYC3互作，通过减少镉积累和增强抗氧化系统提高耐受性。然而，PeCPK21在杨树中是否通过与重金属胁迫相关蛋白（HMAPs）互作调控镉耐受性，其具体分子机制仍不明确。
主要研究结果
1 PeCPK21提高杨树镉耐受性
本研究选择18个PeCPK21转基因杂交杨品系，旨在明确其在镉胁迫下的作用。RT-qPCR、Western blot 结果显示OE10株系的蛋白表达量最高，OE7株系最低。随后，作者选取OE1、OE6、OE10 这3个转基因株系进行后续镉耐受性检测。在500 μM CdCl₂处理30 d后，过表达株系（OE1、OE6、OE10）株高和茎粗增量显著高于野生型（WT），而REL（相对电导率）显著低于WT。结果表明，PeCPK21过表达能够增强杨树镉耐受性。
2 镉对光合与蒸腾的影响
为了研究镉对PeCPK21转基因杨树光合作用与蒸腾作用的影响，作者进一步检测了光合参数（Pn、E、Cleaf），叶绿素含量及荧光指标（Fv/Fm、YII、ETR）。结果显示，OE1、OE6、OE10 的 Pn、E、Cleaf值比野生型高17%–32%，表明PeCPK21过表达可缓解镉胁迫对气孔功能和碳同化的抑制；叶绿素含量及Fv/Fm、YII、ETR的下降幅度均小于野生型，表明PeCPK21可减轻镉对光合色素和光反应系统的损伤。综上所述，PeCPK21过表达可缓解镉对光合系统的抑制。
3 镉对ROS与抗氧化酶的影响
Cd2+积累促进植物细胞产生ROS。作者采用DAB和NBT染色检测H₂O₂和O₂⁻含量，并通过试剂盒测定POD、CAT、SOD活性及相关基因表达。结果显示，CdCl₂处理后，转基因株系ROS积累更少，POD、CAT、SOD活性及对应基因（PcPODa2、PcCAT1等）表达量显著高于WT，表明PeCPK21过表达能够增强杨树抗氧化防御能力。
4 镉的吸收与运输
为进一步研究镉胁迫对Cd²⁺吸收与转运的影响，作者采用原子吸收光谱测定根、茎、叶镉含量，非损伤微测技术（NMT）测定根尖镉通量。结果显示，CdCl₂处理后，转基因株系全株镉积累量及各器官镉含量显著低于WT，根尖Cd²⁺净流入量减少41%-51%，表明PeCPK21过表达能够限制杨树对镉的吸收与转运。
5 PeCPK21互作蛋白鉴定
为深入探究与PeCPK21互作的蛋白，作者采用HaloTag pull-down、SDS-PAGE、LC-MS/MS技术进行富集-分离-鉴定，共鉴定到四类互作蛋白：
（a）重金属转运相关蛋白：例如铜转运蛋白（PcATX1）、钙依赖蛋白激酶（PcCPK2、PcCPK23）以及木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶蛋白6（PcXTH6）；
（b）光合相关蛋白：包括高叶绿素荧光蛋白136（PcHCF136，定位于叶绿体）、光系统Ⅱ10 kDa 多肽（PcPsbR）、捕光复合体类似蛋白（PcOHP1）、光合NDH复合体腔侧亚基5（PcPNSL5）、类囊体弯曲蛋白1A/1B/1C（PcCURT1A/1B/1C，定位于叶绿体）、ATP 合酶α亚基（PcatpA，定位于叶绿体）以及ATP合酶δ亚基（PcATPD，定位于叶绿体）；
（c）膜内在蛋白：如质膜内在蛋白2-5（PcPIP2-5）、液泡膜内在蛋白1-3（PcTIP1-3）和液泡膜内在蛋白2-1（PcTIP2-1）；
（d）抗氧化酶：包括铁型超氧化物歧化酶（PcSOD[Fe]）和L-抗坏血酸过氧化物酶（PcAPX2）。
6 PeCPK21相互作用蛋白的转录本分析
作者采用RT-qPCR检测了CdCl2处理后野生型（WT）和3个转基因株系与PeCPK21相互作用的重金属胁迫相关蛋白（HMAPs）的表达情况。结果显示，转基因株系中光合相关基因（PcHCF136、PcatpA）、重金属转运基因（PcATX1、PcCPK2、PcCPK23和PcXTH6）、抗氧化酶基因（PcAPX2、PcSOD [Fe]）、膜内在蛋白基因（PcPIP2-5、PcTIP1-3和PcTIP2-1）的表达量显著高于WT，且这种高表达更利于杨树应对镉胁迫。
7 PeCPK21与PcXTH6互作及功能
作者采用HaloTag pull-down、Co-IP、LCI进一步验证PeCPK21与PcXTH6互作，并构建过PcXTH6表达株系，测定其镉含量、木葡聚糖降解活性（XDA）及木葡聚糖含量。结果显示，PeCPK21与PcXTH6直接互作，过表达PcXTH6可通过提高XDA、降低木葡聚糖含量，减少细胞壁上的 Cd²⁺结合位点，从而降低杨树对镉的吸收与积累。
8 PeCPK21与PcSOD [Fe]互作及功能
在CdCl₂处理后下，PeCPK21转基因杨树维持了较高的PcSOD[Fe]表达水平，这表明PeCPK21可通过与抗氧化酶相互作用来维持ROS稳态。为明确PcSOD[Fe]在Cd²⁺胁迫下抗氧化防御中的积极作用，作者进一步构建了PcSOD[Fe]过表达株系，并测定其ROS含量及抗氧化酶活性。结果显示，PeCPK21与PcSOD[Fe]互作，过表达PcSOD[Fe] 能显著提高镉胁迫下POD、CAT、SOD活性，减少ROS积累，增强杨树的镉耐受性。
结论
本文综合运用基因过表达、分子互作验证、生理与分子指标测定等方法，证实PeCPK21通过与HMAPs（重金属转运相关蛋白、光合相关蛋白、膜内在蛋白、抗氧化酶）相互作用，限制Cd²⁺积累、增强ROS清除能力、维持光合效率与水分平衡，从而提高欧洲山杨×银白杨对高浓度镉胁迫的耐受性，为木本植物镉耐受遗传改良提供理论依据。
蓝景科信HaloTag pull-down优势：
1、采用真核无细胞蛋白表达系统，表达蛋白可进行翻译后修饰，更接近体内真实蛋白状态。
2、无需转化和鉴定，可直接表达目的蛋白，节省实验时间。
3、蛋白表达成功率高，系统模拟真核细胞折叠环境、无活细胞内空间拥挤限制，表达产物无包涵体。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2025.106216
