Int J Biol Macromol | DAP-seq助力揭示水稻抗病新机制

研究背景

水稻在生长过程中会遭受多种生物胁迫，其中稻瘟病、细菌性叶枯病和纹枯病是最具破坏性的三大病害，会造成全球范围内的粮食减产。植物激素如茉莉酸（JA）等可介导复杂的信号网络以激活水稻的免疫反应。MYC转录因子是JA信号的主要调节因子，而泛素化作为重要的蛋白质翻译后修饰，在植物免疫中发挥关键作用。此前研究发现水稻RING型E3泛素连接酶OsBBI1可正向调控水稻对稻瘟病的抗性，但其作用机制尚不明确。

文献解读

2025年6月，浙江大学生物技术研究所宋凤鸣团队在《International Journal of Biological Macromolecules》发表了题为“Rice E3 ubiquitin ligase BLAST AND BTH-INDUCED1 targets jasmonic acid signaling co-repressors to release Myelocytomatosis protein 2 for modulating immune responses against blast fungus”的研究论文。本研究借助DAP-seq技术，深入探索了OsBBI1调控水稻免疫的分子网络，揭示了其通过降解JA信号抑制因子、释放关键转录因子的完整抗病通路。

技术路线

研究结果

研究团队通过酵母双杂交（Y2H）、双荧光素酶互补（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down、荧光素酶互补（LCI）等技术，发现OsBBI1能直接结合JA信号通路中的抑制蛋白OsJAZ6、OsJAZ7、OsJAZ8及OsNINJA1。体外泛素化实验、几丁质诱导的ROS爆发实验和细胞降解实验进一步证实，OsBBI1通过其RING结构域催化这些蛋白的泛素化修饰，并促使它们通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）降解。证实OsBBI1通过降解JA信号的抑制蛋白（OsJAZs和OsNINJA1），解除其对免疫反应的抑制。当稻瘟病菌入侵时，OsBBI1能快速清除这些抑制因子，激活免疫反应。

图1. OsBBI1与OsJAZ6、OsJAZ7和OsJAZ8相互作用并使其泛素化。

图2. OsBBI1介导OsJAZ6和OsJAZ7的降解。

图3. OsJAZ6、OsJAZ7和OsJAZ8负调控水稻稻瘟病抗性及几丁质触发的免疫反应。

图4. OsBBI1和OsJAZ6与OsNINJA1相互作用，且OsBBI1抑制OsJAZ6和OsNINJA1的负向免疫功能。

通过BiFC、GST pull down和亚细胞定位分析，证实OsJAZ6与OsMYC2、OsMYC3相互作用，且OsMYC2与OsMYC3可形成同型/异型二聚体，主要分布于细胞核中。利用CRISPR/Cas9 技术构建OsMYC2过表达株系和Osmyc3敲除突变体，结合稻瘟病菌接种实验、RT-qPCR和DAB染色，发现过表达植株的病斑更少、更小，真菌生长也更少，相应的OsPBZ1和OsJAmyb的表达显著上调，H₂O₂积累增强；而突变体株系则相反。这些结果表明，OsMYC2和OsMYC3通过促进病原体诱导的防御基因表达和活性氧（ROS）积累，正向调控水稻对稻瘟病菌的免疫反应。

图5. OsBBI1、OsJAZ6和OsNINJA1与OsTPL、OsTPR2、OsMYC2及OsMYC3存在相互作用。

图6. OsMYC2和OsMYC3对水稻稻瘟病抗性起正向调控作用。

为了进一步研究OsMYC2的调控机制，本研究利用DAP-seq技术分析了OsMYC2在全基因组的结合位点。在两个独立的生物学重复中分别获得了5776个和3281个假定结合峰，其中2038个为重叠结合峰。通过生物信息学分析发现，30.3%的结合峰富集于基因启动子区域，表明OsMYC2主要通过调控启动子区域基因表达发挥功能。结合峰在水稻各染色体上呈非偏倚性分布，涉及1084个基因的启动子，KEGG富集分析显示，其显著富集于次生代谢物生物合成、植物激素信号转导、MAPK信号通路。结合ChIP-PCR、EMSA和荧光素酶报告基因实验，证实OsMYC2可通过结合OsGST、OsOXO3、OsOXO4、OsZIP9等防御基因启动子中的G-box元件，直接调控其转录表达。结果表明OsMYC2是连接OsBBI1与下游免疫反应的核心枢纽。当OsJAZs被降解后，OsMYC2进入细胞核，与OsMYC3联手启动抗氧化酶、金属转运蛋白等基因的表达，增强水稻对病菌的抵抗能力。

图7. OsMYC2通过结合启动子中的G-box元件调控OsGST、OsOXO3、OsOXO4和OsZIP9的表达。

该研究突破了传统对JA信号调控的认知，构建了“OsBBI1→降解JA抑制因子→释放OsMYC2→激活防御基因”的完整调控链，证实E3泛素连接酶可通过“降解抑制因子”的方式快速激活免疫，为作物抗病机制研究提供了新思路。

图 8. OsMYC2激活OsOXO4和OsZIP9的转录，并提出OsBBI1-OsJAZ6-OsMYC2模块在水稻免疫中功能的工作模型。

原文链接： https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40543771/