文章分享|ChIP-seq：如何解开拟南芥复制应激谜团？

2023年7月，在《Molecular Plant》期刊上发表的一篇研究论文“Distinctive and complementary roles of E2F transcription factors during plant replication stress responses”，该研究以拟南芥为对象，探究E2FA和E2FB转录因子在植物应对复制应激反应中的作用。

DNA精确复制对生物遗传稳定性至关重要，但多种因素会引发复制应激，威胁基因组完整性。植物受胁迫时触发的DDR可能与复制应激增加有关，其DDR依赖ATM和ATR激活，SOG1参与调控，但部分转录反应受未知因子影响。拟南芥的E2F家族成员各有“分工”，E2FA和E2FB部分功能还存在重叠，它们在这场关乎植物生死的战斗中，究竟是如何发挥作用的？

研究人员运用多种实验方法，借助ChIP-seq技术发现了它们与SOG1之间千丝万缕的联系——大量共同靶基因和相近的结合位点，这一发现就像一把钥匙，似乎要打开植物应对复制应激反应机制的神秘大门。这扇大门背后究竟隐藏着哪些惊人的秘密？让我们一同深入文章，探寻其中的奥秘吧！

技术路线

研究结果

1.E2FA、E2FB与SOG1共享一些靶基因

本研究选用拟南芥作为研究对象，通过ChIP-seq技术分析，对比E2FA、E2FB与SOG1的靶基因并确定它们在靶基因上的结合位点，结果发现三者存在大量共同靶基因，如WEE1基因，它们在靶基因上的结合位点相近。GUS染色实验发现E2FA/B可独立于SOG1激活WEE1，表明E2FA/B可能参与复制应激反应。

图1. E2FA、E2FB和SOG1共享共同的目标基因，并独立激活WEE1。

2.E2FB的缺失会严重加剧复制压力引起的生长缺陷

为了探讨E2FA和E2FB在复制应激反应中的作用，以pol2a-4突变体为基础，构建与sog1、e2fa或e2fb的双突变和三突变体，观察各突变体的生长表型，结果显示，e2fb-1 pol2a双突变体和e2fb-1 pol2a sog1三突变体的生长缺陷比pol2a和pol2a sog1更严重，而e2fa-1突变对生长影响不明显。分析各种突变体的根长数据，发现E2FB而非E2FA对于在持续复制压力下生长的植物根部生长是必需的。这些结果表明，E2FB有助于植物对复制压力的响应，即使存在复制缺陷也能维持生长。

图2. E2FB，而不是E2FA，是植物在复制压力下持续生长所必需的。

3.E2FB在应对复制压力时正向调节分生组织大小和细胞周期进展

通过激光扫描共聚焦显微镜观察，发现复制应激会导致根分生组织大小减小。细胞周期分析显示，E2FB缺失会延迟S期和G2-M期的进程，表明E2FB正调控细胞周期进程，尤其是在G2期和G2/M转换期。通过流式细胞术检测花buds也得到了相同的结果。以上结果表明，E2FB通过复制压力暴露的细胞中G2期的进展和G2/M期的开始来正向调节细胞周期的进展。

图3. E2FB缺失，而不是E2FA缺失，通过延迟细胞周期的进展，进一步减少了pol2a背景下的根顶端分生组织长度。

4.复制应激诱导基因受E2Fs和SOG1双重控制

通过对pol2a、pol2a sog1和e2fb-1 pol2a sog1突变体的茎尖进行RNA-seq分析，发现1095个基因在三种突变体中均上调，这些基因与DNA修复、复制和细胞周期负调控相关。SOG1靶基因可分为三组，分别主要受SOG1调控、受SOG1和E2FB拮抗调控、受E2FA和E2FB冗余激活且部分依赖SOG1，表明E2Fs和SOG1对DDR基因存在复杂的调控关系。

图4. E2FB和SOG1协同控制复制应激诱导的转录变化。

5.E2FA、E2FB和SOG1协同促进细胞周期进程

首先构建e2fa-2 e2fb-1 sog1三突变体，用HU诱导复制应激，发现sog1突变体对复制应激略有敏感性，而e2fa、e2fb单突变体以及e2fa-2 e2fb-1双突变体则无明显的这种超敏感性。e2fb-1 sog1双突变体比sog1突变体对HU更敏感，这与E2FB在复制应激反应中比E2FA发挥更重要作用的假设相符。值得注意的是，e2fa-2 e2fb-1 sog1三突变体对HU表现出更强的超敏感性，其根生长在转移到HU后几乎完全被阻断，并且根分生组织中出现细胞死亡。

进一步探究了E2F缺失的影响，研究人员发现，在野生型背景下，E2F缺失可能会引发复制应激。e2fa-2 e2fb-1双突变体表现出S期延长和总细胞周期长度增加的现象，且这些缺陷在sog1突变体背景下消失，这表明E2F缺失会触发复制应激，进而导致SOG1依赖的细胞周期延迟。通过对7日龄幼苗根尖的RNA-seq分析，研究人员发现e2fa-2 e2fb-1双突变体中有148个基因下调，其中73个可能是E2FA或E2FB的直接靶基因；同时有345个基因上调，其中145个是E2FA或E2FB结合的基因，且这些上调基因中43个是SOG1的靶基因，这进一步证实了E2FA和E2FB缺失会触发复制应激，并导致SOG1依赖的DDR基因激活。

图5. E2FA、E2FB和SOG1的同时缺失消除了植物对复制应激的耐受性。

图6. E2F缺失会引发复制压力、SOG1依赖的细胞周期延迟和DDR基因的激活。

综上所述，本研究揭示了一个复杂的转录网络，该网络在植物应对复制应激反应中发挥着关键调控作用，其中E2Fs和SOG1作为核心调节因子，共同维持植物基因组的稳定性和细胞周期的正常运行。

图7. SOG1、E2FA和E2FB作用于不同的共同靶点，以微调植物DDR。

原文链接：https://www.cell.com/molecular-plant/fulltext/S1674-2052(23)00178-8